Abstrakt
In vitro test pro kvantitativní stanovení phenytoinu v séru
soupravou PHNY2 ROCHE na analyzátoru Cobas pure.
Seznam
souvisejících dokumentů
Uživatelská
příručka Roche Cobas pure
Bezpečnostní list Roche
PHNY2
Příbalový leták PHNY2 –
cobas pure
OKB PN – SM – 006
Manipulace se vzorky
OKB PN – SM – 009 Práce
s biologickým materiálem
OKB PN – SM – 002
Bezpečnost práce
Kódy,
názvy, definice a terminologie
Phenytoin, PHNY2, LIS – 355, VZP 99139
Rutinní a statimová metoda, používá se kazeta COBAS Pure Phenytoin
(PHNY2), obsahuje diagnostické reagencie určené pro in vitro kvantitativní stanovení phenytoinu v séru nebo plasmě
systémem COBAS Pure (test PHNY2, test ID 2098 002, katalogové číslo 08445567190. Souprava obsahuje 100 testů a nachází se v
místnost biochemie.
Princip a metoda postupu
Stanovení je založeno
na kinetické interakci v roztoku (KIMS). Protilátka proti fenytoinu je
kovalentně vázána na mikročástice a derivát léčiva je připojen
k makromolekule. Kinetická interakce mikročástic v roztoku, která je
detekovaná fotometricky měřením turbidity, je vyvolaná vazbou konjugátu léku na
protilátky nacházející se na mikročástici a je inhibována přítomností fenytoinu
ve vzorku. Mezi konjugátem léku a fenytoinem ve vzorku séra probíhá
kompetitivní reakce o vazbu na protilátky proti fenytoinu navázané na
mikročásticích. Výsledná turbidita je nepřímo úměrná množství léčiva ve vzorku.
Místo provádění postupu
Oddělení klinické biochemie PN v Opavě, Olomoucká 88, 746 01 Opava
Bezpečnostní aspekty a podmínky prostředí
Je nutné dodržovat
obecné zásady bezpečnosti práce podle ČSN 01 8003, ale i zásady práce s biologickým
materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí. Zejména je třeba
zachovávat pravidla osobní hygieny, používat osobní ochranné pracovní
prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po práci
a před jídlem omýt pokožku především rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit
vhodným reparačním krémem (viz zásady bezpečnosti práce). Při zasažení očí
vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut. Při zasažení oděvu a
kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži omýt velkým
množstvím pokud možno vlažné vody popř. mýdlem nebo jiným vhodným mycím
prostředkem. Po umytí ošetřit vhodným reparačním krémem. Při náhodném požití
vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2 litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.
Fáze
před vyšetřením (příprava pacienta)
Phenytoin (diphenylhydatoin) je často užíván pro lepší
podchycení a kontrolu pacientů trpících epileptickými příhodami grand mal,
kortikálními fokálními příhodami a temporální epilepsií. Stanovení hladiny léku
v séru má napomoci ustanovit optimálně nízkou hladinu při zachování
maximální kontroly. Z důvodů individuálních odlišností v absorpci a
metabolismu jsou optima hladiny různé.
Odběr
primárního vzorku (druh, nádobka, transport)
Pro odběr a přípravu vzorků používejte pouze
vhodné zkumavky nebo odběrové nádobky. Uvedené druhy vzorků byly testovány
s vybranými typy odběrových zkumavek, které byly komerčně dostupné
v té době, tzn, že do testu nebyly zahrnuty všechny typy zkumavek všech
výrobců. Systémy odběru vzorků různých výrobců mohou obsahovat různé materiály,
které mohou mít v některých případech vliv na výsledky. Při zpracování
vzorků v primárních zkumavkách dodržujte pokyny jejich výrobce.
Stanovení se provádí v nehemolytickém séru nebo
v plazmě (Li-heparinizovaná, Na-heparinizovaná, K2-, K3-EDTA).
Speciální příprava pacienta ani dieta není nutná.
Odběr se provádí ze žíly.
Obvyklá doba odběru
v závislosti na dávkování a velikosti dávek léčiva.
Vzorky obsahující precipitáty, centrifugujte
před provedením testu.
Stabilita: 4 dny při 15 – 25 °C.
Musí-li být vzorky uskladněny pro pozdější testování, měly by být uloženy
uzavřené při 4 – 8 °C po dobu max. 4 dní nebo při – 20°C po dobu max. 2 měsíců.
Zabraňte opakovanému mrazení a rozmrazování. Rozmrazené vzorky před použitím
několikrát promíchejte obracením.
Omezení
(interference a zkřížené reakce)
Viz.
Příbalový leták PHNY2, str.2/4.
Manipulace se vzorky
Podle běžných zásad práce s biologickým infekčním materiálem.
Přístroje a pomůcky
Analyzátor ROCHE Cobas pure – viz. SOPT Cobas
pure
Reagencie
Souprava
obsahuje
·
činidla R1
(v pozici B)
·
činidlo R2
(v pozici C)
Činidlo R1 Konjugát fenytoinu, piperazin –N,N-bis (kys.
ethansulfonová) (PIPES) pufr, pH
7,3, stabilizátor,
konzervans
Činidlo R2 Protilátka proti fenytoinu (myší
monoklonální), latexové mikročástice
3-(N-morfolin) propansulfonová
kyselina (MOPS) pufr, pH 7,4
Stabilizátor, konzervans
Doba skladování: při teplote 2 – 8
°C dle datumu exspirace reagencie, po otebření na palubě analyzátoru
v chlazeném prostoru 12 týdnů.
Spotřební materiál
Microcups typu Hitachi.
Pracovní postup
Kazetu Cobas pure PHNY2
umístíme do prostoru pro reagencie. Připravíme kontrolní séra, které umístíme
do příslušného stojanu do předem definovaných pozic a po ukončení měření QC
modul v analyzátoru a také v LIS vyhodnotí výsledky pomocí Westgardových
pravidel a určený pracovník, který rozhodne, zda odpovídající analýza může
probíhat. Celková koncentrace se zjistí výpočtem podle optimální kalibrační
křivky pomocí software analyzátoru.
Stanovení je měřeno při 37 °C při primární vlnové délce A/B 800/600 nm. Při
koncentraci vyšší než měřící rozsah je výsledek označen kódem pro opakování
měření z naředěného vzorku. Pipetuje se 1,2 µl séra.
Stručný popis postupu
Obsluha provede kontrolu reagencií, kalibraci
metod a následnou kontrolu metod (kontrolu provádí vysokoškolský určený
pracovník). Analyzovaný materiál se umístí do určených stojánků dle matrice analyzovaného
materiálu označený čárovým kódem. Požadavky analýz se předají do cobas pure
on-line přes čárový kód z LIS a po provedení analýzy se převedou
elektronicky zpět. Tyto výsledky jsou uchovávány v laboratorním systému
LIMS fy DS Soft Olomouc.
Kalibrace a návaznost
Ke
kalibraci se využívá přípravek Preciset TDM I, katalogové číslo 03375790190,
výrobce ROCHE. Plná kalibrace je šestibodová: S1-6: Kalibrátory Preciset TDM I.
Režim kalibrace je nelineární.
Návaznost: Tato metoda byla standardizována podle
USP referenčních standardů. Kalibrátory jsou připravovány tak, aby obsahovaly
známé množství phenytoinu v normálním lidském séru.
Frekvence kalibrace: po změně šarže reagencie,
podle požadavků provádění kontroly kvality, dané frekvence buď plných nebo jen
2-bodových kalibrací jsou taktéž předvoleny v software analyzátoru.
Kalibrátory jsou již připraveny k použití.
Kalibrátor je stabilní do data uvedeného na obalu.
Kalibrátor byl připraven z krve dárců, testovaných individuálně na
přítomnost HBsAG, HCV a HIV protilátek. Je nutné s ním zacházet dle pravidel o
bezpečnosti práce s biologickým materiálem.
Koncentrace se vybírá v přiloženém atestu ke kalibrátoru
a závisí na šarži a metodě. Kalibrace může být plná –
6-bodová, nebo jen 2-bodová, závislost je nelineární. Rekalibrace
metody se provádí na základě výsledků kontroly správnosti. Kalibrační
data jsou automaticky archivována v softwaru analyzátoru.
Charakteristika spolehlivosti
Měřící rozsah
3,2 – 158,4 umol/l
Mez
detekce 3,2 umol/l
Mez detekce
představuje nejnižší měřitelnou hladinu analytu, kterou lze odlišit od nulového
kalibrátoru s 95 % pravděpodobností.
Mez stanovitelnosti 6,3 umol/l
Mez
stanovitelnosti je nejnižší koncentrace analytu, kterou lze reprodukovatelně
měřit s celkovou chybu 20 %. Stanovena byla použitím vzorků fenytoinu
s nízkými koncentracemi.
Dokumentace, výpočty, zpracování dat a vydávání výsledků
Hodnoty
poslední provedené kalibrace se uchovávají v paměti přístroje. V případě potřeby je možné je vytisknout.
Záloha
veškerých primárních dat (kalibrace, kontrolní vzorky, pacientské vzorky)
probíhá na analyzátoru Cobas pure každý den automaticky na flash disk umístěný
v počítači analyzátoru a sekundární data (pacientské vzorky, QC) jsou
zálohovány v LIS taktéž každý den automaticky probíhající zálohou LIS.
Referenční, varovné nebo kritické hodnoty
Terapeutické rozmezí phenytoinu
je porovnáváno s účinností kontroly záchvatů a absencí toxických účinků,
všeobecně je však stanoveno mezi 39,6 až 79,2 umol/l. Nicméně
individuální odlišnosti v absorpci a metabolismu léčiva může způsobit, že
optimum leží vně všeobecně deklarovaného terapeutického rozmezí, tzn. více než
79,2 umol/l nebo klesnout pod 39,6 umol/l. Známky toxicity se zřídka objevují
pod 59,4 umol/l, zatímco nystagmus se nejčastěji objevuje při překročení
hladiny 79,2 umol/l. Ataxie se nejčastěji objevuje při hladinách 99 – 119
umol/l a somnolence a dysartrie nad 158 umol/l. Při vysokých dávkách může
fenytoin dokonce způsobit častější výskyt záchvatů.
Interpretace
výsledků, konzultační činnosti a hlášení
Hodnoty se
udávají v umol/l, po kontrole na oddělení. Výsledky se vydávají
v elektronické a i papírové podobě, statimové a kritické výsledky
podléhající hlášení jsou hlášeny telefonicky.
Řízení kvality
Jako kontrolní materiál správnosti metody se používají TDM Control
Set Level I, II, III. fy ROCHE. Do měření
se zařazují dle Směrnice pro IKK. Kontrolu provádí vysokoškolský pracovní podle
Westgardových pravidel a v případě
nevyhovující kvality podniká určitá opatření (kalibrace, nové reagencie, a
pod).
EHK
Externí
kontrola kvality v rámci České republiky je organizována SEKK, laboratoř se jí
účastní 2x ročně
v rámci
cyklu TDM.
Poznámky,
zdroje variability
Převodní faktor: umol/l * 3,96 = mg/dl
Jiné související informace
Vzorek,
jehož výsledek je vyšší, než je hodnota nejvyššího kalibrátoru je systémem
označen a musí se ručně naředit nulovým kalibrátorem.
Literatura
·
Uživatelská
příručka Cobas pure
·
Racek, J.
Klinická biochemie, Galén, 2021
·
Richard
Češka a kol.: Interna. 1. Praha: Triton 2010
Appendixy
Autorské poznámky
Doporučení, recenze, schválení
Autor a spoluautoři: Stanovská Lenka
Vyjádření:
Revize: