OSN-SAbstraktOSN-E

Stanovení cholesterolu HDL enzymaticky fotometrickým testem v séru soupravou HDLC4 fy ROCHE na analyzátoru Cobas Pure.

OSN-SSeznam souvisejících dokumentůOSN-E

Uživatelská příručka Roche Cobas pure

Bezpečnostní list Roche HDLC4

Příbalový leták HDLC4 – cobas pure

OKB PN – SM – 006 Manipulace se vzorky

OKB PN – SM – 009 Práce s biologickým materiálem

OKB PN – SM – 002 Bezpečnost práce

OSN-SKódy, názvy, definice a terminologieOSN-E

HDL-cholesterol, High density lipoproteins-cholesterol, VZP 81473, LIS - 56

Rutinní metoda, používá se Kazeta COBAS Pure HDL-Cholesterol plus 4. generace (HDLC4), obsahuje diagnostické reagencie určené pro in vitro kvantitativní stanovení HDL cholesterolu v séru a plazmě systémem COBAS Pure, fy ROCHE, obsahuje 700 testů, ID 2071 002, katalogové číslo 08057877190. Souprava je umístěna v lednici, místnost biochemie.

OSN-SPrincip a metoda postupuOSN-E

Homogenní enzymatické fotometrické stanovení.

Non-HDL lipoproteiny jako LDL, VLDL a chylomikrony se pojí s polyanionty a detergentem za vzniku ve vodě rozpustného komplexu. V tomto komplexu je enzymová reakce non-HDL lipoproteinů s CHER a CHOD zablokovaná. CHER a CHOD mohou reagovat pouze s HDL-částicemi. Koncentrace HDL-cholesterolu se měří enzymaticky prostřednictvím CHER a CHOD. Estery cholesterolu jsou kvantitativně štěpeny pomocí CHER na volný cholesterol a MK. V přítomnosti kyslíku je cholesterol oxidován cholesteroloxidázou na 4-cholesterol a peroxid vodíku. V přítomnosti peroxidázy reaguje vytvořený peroxid vodíku s 4-aminoantipyrinem a EMSE a vytváří zbarvení. Jeho intenzita je přímo úměrná koncentraci cholesterolu a měří se fotometricky.

OSN-SMísto provádění postupuOSN-E

Oddělení klinické biochemie PN v Opavě, Olomoucká 88, 746 01 Opava

OSN-SBezpečnostní aspekty a podmínky prostředíOSN-E

Je nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti práce podle ČSN 01 8003, ale i zásady práce s biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí. Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní hygieny, používat osobní ochranné pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku především rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním krémem (viz zásady bezpečnosti práce). Při zasažení očí vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut. Při zasažení oděvu a kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži omýt velkým množstvím pokud možno vlažné vody popř. mýdlem nebo jiným vhodným mycím prostředkem. Po umytí ošetřit vhodným reparačním krémem. Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2 litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.

OSN-SFáze před vyšetřením (příprava pacienta)OSN-E

High density lipoproteins (HDL) neboli lipoprotein o vysoké hustotě je odpovědný za zpětný transport cholesterolu z periferních buněk do jater. Tam je cholesterol přeměněn na žlučové kyseliny, které jsou žlučovými cestami vylučovány do střeva. Monitorování hladiny HDL cholesterolu má svůj klinický význam pro posouzení závažnosti rizika onemocnění aterosklerózou, se kterým je hodnota HDL cholesterolu v nepřímé úměře. Zvýšené hodnoty HDL cholesterolu působí jako ochranný faktor před koronárním onemocněním, zatímco nízké hodnoty, zvláště ve spojitosti se zvýšenou hladinou triacylglyceridů, znamenají zvýšené riziko. Pro stanovení HDL cholesterolu je možno použít vícero metod včetně ultracentrifugace, elektroforézy, HPLC a metod na bázi precipitace. Z nich jen techniky s precipitací se dočkaly rutinního použití. HDL cholesterol je v prvním kroku odděleny pomocí precipitace lipoproteiny obsahujících apoprotein B. Precipitace probíhá v prostředí kombinující účinky polyaniontů a divalentních kationtů jako jsou dextran sulfát/chlorid hořečnatý nebo fosfotungstát/chlorid hořečnatý. Tyto metody jsou časově náročné a neumožňují automatizaci analýzy a tak vznikla potřeba metody měření HDL cholesterolu bez přípravných kroků. Bylo vyzkoušeno několik způsobů, jak přímo měřit HDL cholesterol. Namátkou lze jmenovat použití magnetických částic v kombinaci s metalickým polyaniontem nebo polyethylen glykol (PEG) s protilátkami proti apoproteinu B a apoproteinu CIII.

Kazeta COBAS Pure HDL-Cholesterol je navržena pro přímé specifické stanovení HDL-cholesterolu v přítomnosti částic VLDL, LDL a chylomiker bez nutnosti přípravných kroků.

OSN-SOdběr primárního vzorku (druh, nádobka, transport)OSN-E

Pro odběr a přípravu vzorků používejte pouze vhodné zkumavky nebo odběrové nádobky.

Sérum a plazma (Li-heparinizovaná, K2-, K3-EDTA).

Odběr se provádí ze žíly. Sérum je nutné oddělit od krevních elementů pokud možno nejrychleji.

Vzorky obsahující precipitáty centrifugujte před provedením stanovení.

Krev odebírejte použitím vakuové zkumavky nebo stříkačky. Vzorky by měly být analyzovány v den odběru.

Stabilita: v séru: 72 hodin při 15-25 °C, 7 dní při 2 – 8°C, 12 měsíců při – 20°C.

OSN-SOmezení (interference a zkřížené reakce)OSN-E

Viz. Příbalový leták HDLC4, str. 2/5.

OSN-SManipulace se vzorkyOSN-EOSN-E

Podle běžných zásad práce s biologickým infekčním materiálem.

OSN-SPřístroje a pomůckyOSN-E

Analyzátor fy ROCHE Cobas pure – viz. SOPT Cobas pure.

OSN-SReagencieOSN-E

Souprava obsahuje:

· činidlo R1

· činidlo R3

Činidlo R1 (v pozici B) TAPSO pufr 62,1 mmol/l

EMSE 1,08 mmol/l

Polyanion 1,25 g/l

Hov. Sérový albumin 2,0 g/l

AOD (rekombinantní) > 50 µkat/l

POD (křenová) > 166,7 µkat/l

Detergent

konzervans

Činidlo R3 (v pozici C) CHOD (E. coli) > 7,17 µkat/l

Bis-Tris pufr 20,1 mmol/l, pH 6,7

CHER (mikrobiální) > 7,5 µkat/l

CHOD (Mikrobiální) >76,7 µkat/l

Peroxidáza křenová >333 µkat/l

4- aminoantipyrin 1,48 mmol/l

Hov. Sérový albumin 3,0 g/l

Detergent

Konzervans

Činidla jsou stabilní do vyznačené doby expirace na štítku reagencie při 2 – 8 °C, po otevření vna palubě analyzátoru v chlazeném prostoru je stabilní v přístroji 12 týdnů.

OSN-SSpotřební materiálOSN-E

Microcups typu Hitachi.

OSN-SPracovní postupOSN-E

Kazetu Cobas pure HDLC4 umístíme do prostoru pro reagencie. Připravíme kontrolní séra, které umístíme do příslušného stojanu do předem definovaných pozic a po ukončení měření QC modul v analyzátoru a také v LIS vyhodnotí výsledky pomocí Westgardových pravidel a určený pracovník, který rozhodne, zda odpovídající analýza může probíhat. Celková koncentrace se zjistí výpočtem podle optimální kalibrační křivky pomocí software analyzátoru.

Stanovení je měřeno při 37 °C při primární vlnové délce A/B 700/600 nm. Při koncentraci vyšší než měřící rozsah je výsledek označen kódem pro opakování měření z naředěného vzorku. Pipetuje se 1,6 µl séra.

OSN-SStručný popis postupuOSN-E

Obsluha provede kontrolu reagencií, kalibraci metod a následnou kontrolu metod (kontrolu provádí vysokoškolský určený pracovník). Analyzovaný materiál se umístí do určených stojánků dle matrice analyzovaného materiálu označený čárovým kódem. Požadavky analýz se předají do cobas pure on-line přes čárový kód z LIS a po provedení analýzy se převedou elektronicky zpět. Tyto výsledky jsou uchovávány v laboratorním systému LIMS fy DS Soft Olomouc.

OSN-SKalibrace a návaznostOSN-E

Ke kalibraci se používá přípravek Calibrator for automated systems Lipids (C.f.a.s.), výrobce fy ROCHE. Je to lyofilizované kalibrační sérum, na bázi lidského séra. Koncentrace a aktivity byly vybrány tak, aby zajistily optimální kalibraci automatických analyzátorů, které nepoužívají kontinuální průtokový systém. Specifikované standardní hodnoty jsou mediánem získaných hodnot.

Návaznost: Tato metoda byla standardizována podle CDC referenční metody (ultracentrifugační metoda). Standardizace přinesla požadavek na HDL Chlesterol Method Evaluation Protocol for Manufacturers od US National Reference Systém for Cholesterol, CRMLN (Cholesterol Reference Method Laboratory Network), listopad 1994.

Frekvence kalibrace: po změně šarže reagencie, podle požadavků provádění kontroly kvality.

Příprava

Po opatrném otevření lahvičky, aby se zabránilo jakékoliv ztrátě lyofilizátu, se přidá přesně 1 ml redestilované vody. Lahvička se pečlivě uzavře a obsah se rozpustí během 30 minut, za občasného opatrného promíchání kroužením lahvičky tak, aby se zabránilo pěnění. Netřepe se.

Stabilita

Kalibrátor v lyofilizovaném stavu je stabilní do data na obalu. Po rozpuštění jsou složky kalibrátoru stabilní nejméně 8 hodin při laboratorní teplotě, 2 dny při 4 °C a 1 měsíc při -20 °C, pokud bylo jednou zamraženo. Kalibrátor byl připraven z krve dárců, testovaných individuálně na přítomnost HBsAG, HCV a HIV protilátek. Je nutné s ním zacházet podle pravidel o bezpečnosti práce s biologickým materiálem

Vlastní kalibrace

Kalibrační závislost je lineární, přímka prochází počátkem. Koncentrace závisí na šarži kalibrátoru a použité metodě. Výpočet kalibrační funkce je zajištěn prostřednictvím softwaru analyzátoru. Kalibrace se provádí na základě kontroly správnosti - dle potřeby. Způsob kalibrace je lineární, údaje o kalibraci jsou k dispozici v softwaru analyzátoru.

OSN-SCharakteristika spolehlivostiOSN-EOSN-S OSN-E

Měřící rozsah: 0,08 – 3.88 mmol/l

Vzorky s vyššími koncentracemi stanovte použitím funkce rerun. Vzorky nařeďte 1:2 pomocí této funkce, výsledky jsou automaticky vynásobeny faktorem 2.

Mez detekce 0,08 mmol/l

Mez detekce představuje nejnižší měřitelnou hladinu analytu, kterou lze odlišit od nuly. Počítá se jako hodnota ležící 3 SD od nulového vzorku (nulový vzorek + 3 SD, opakovatelnost, n = 21).

Mez stanovitelnosti 0,08 mmol/l

Mez stanovitelnosti je nejnižší koncentrace analytu, kterou lze reprodukovatelně měřit s chybou do 30 %. Měření bylo provedeno použitím vzorků HDL-cholesterolu s nízkými koncentracemi.

Biologický rozptyl - intraindividuální:

- interindividuální:

- celkový

OSN-SDokumentace, výpočty, zpracování dat a vydávání výsledkůOSN-E

Hodnoty poslední provedené kalibrace se uchovávají v paměti přístroje. V případě potřeby je možné je vytisknout.

Záloha veškerých primárních dat (kalibrace, kontrolní vzorky, pacientské vzorky) probíhá na analyzátoru Cobas pure každý den automaticky na flash disk umístěný v počítači analyzátoru a sekundární data (pacientské vzorky, QC) jsou zálohovány v LIS taktéž každý den automaticky probíhající zálohou LIS.

OSN-SReferenční, varovné nebo kritické hodnotyOSN-E

Referenční hodnoty: mmol/l

Ženy 1,20 – 2,70

Muži 1,00 – 2,10

HDL cholesterol je ovlivňován množstvím faktorů jako např. kouření, tělesný pohyb, hormony, pohlaví, věk.

OSN-SInterpretace výsledků, konzultační činnosti a hlášeníOSN-E

Hodnoty se udávají v mmol/l, po kontrole na oddělení. Výsledky se vydávají v elektronické a i papírové podobě, statimové a kritické výsledky podléhající hlášení jsou hlášeny telefonicky.

OSN-SŘízení kvalityOSN-E

Jako kontrolní materiál se používá PreciControl ClinChem Multi 1 a PreciControl ClinChem Multi 2 fy ROCHE, lyofilizované kontrolní séra na základě bovinního albuminu se základními aktivitami v normálním rozmezí. Přidané enzymy zvířecího původu mají vlastnosti podobné enzymům z lidského séra.

Připravují se dokonalým rozpuštěním obsahu lahvičky v 5 ml deionizované vody za pomalého kroužení. Po 5 minutách jsou připraveny k použití, pro stanovení ALP se nechává stát další 1 hodinu při laboratorní teplotě. Používají se stejným způsobem jako vzorek, datum exspirace je udáno na každém balení.

Do měření se zařazují každý den a výsledky jsou vyhodnoceny podle Westgardových pravidel v analyzátoru v QC modulu a taktéž v LIS v QC modulu. Veškeré NO v QC jsou zdokumentovány v LIS.

OSN-SPoznámkyOSN-E

OSN-SJiné související informaceOSN-E

OSN-SLiteraturaOSN-E

· Příbalový leták HDLC4

· Uživatelská příručka Cobas pure

· Racek, J. Klinická biochemie, Galén, 2021

· Richard Češka a kol.: Interna. 1. Praha: Triton 2010, str. 256

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

OSN-SDoporučení, recenze, schváleníOSN-E

Autor a spoluautoři: Stanovská Lenka

Vyjádření:

Revize: