OSN-SAbstraktOSN-E

Stanovení celkového cholesterolu enzymaticky fotometrickou metodou v séru soupravou CHOL2 fy ROCHE na analyzátoru Cobas pure.

OSN-SSeznam souvisejících dokumentůOSN-E

Uživatelská příručka Roche Cobas pure

Bezpečnostní list Roche CHOL2

Příbalový leták CHOL2– cobas pure

OKB PN – SM – 006 Manipulace se vzorky

OKB PN – SM – 009 Práce s biologickým materiálem

OKB PN – SM – 002 Bezpečnost práce

OSN-SKódy, názvy, definice a terminologieOSN-E

Cholesterol, LIS – 8, VZP 81471

Rutinní metoda, používá se kazeta COBAS Pure Cholesterol (CHOL2), která obsahuje diagnostické reagencie určené pro in vitro kvantitativní stanovení koncentrace celkového cholesterolu v séru a plasmě systémem COBAS Pure (test CHOL2, ID 2041 001), fy ROCHE, doporučená SKB ČLS JEP, katalogové číslo 08057443190. Souprava obsahuje 2600 testů a je umístěna v lednici, místnost biochemie.

OSN-SPrincip a metoda postupuOSN-EOSN-EOSN-E

Estery cholesterolu jsou působením cholesterolesterázy (CE) rozštěpeny na cholesterol a mastné kyseliny. Cholesterol je oxidován kyslíkem za přítomnosti cholesteroloxidázy (CHOD) na cholest-4-en-3-on a peroxid vodíku. V přítomnosti peroxidázy (POD) vzniklý peroxid vodíku umožňuje oxidativní kopulaci fenolu a 4-aminoantipyrinu (4-AAP) za vzniku červeného barviva.

_CE

estery cholesterolu + H₂O ¾¾¾¾¾> cholesterol + mastné kyseliny

_{C H O D}

cholesterol + O₂ ¾¾¾¾¾> cholest-4-en-3-on + H₂O₂

_{P O D}

2 H₂O₂ + 4-AAP + fenol ¾¾¾¾¾> chinoniminové barvivo + 4 H₂O

Intenzita zbarvení vzniklého červeného chinoniminového barviva je přímo úměrná koncentraci cholesterolu. Je stanovena měřením nárůstu absorbance.

OSN-SMísto provádění postupuOSN-E

Oddělení klinické biochemie PN v Opavě, Olomoucká 88, 746 01 Opava.

OSN-SBezpečnostní aspekty a podmínky prostředíOSN-E

Je nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti práce podle ČSN 01 8003, ale i zásady práce s biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí. Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní hygieny, používat osobní ochranné pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku především rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním krémem (viz zásady bezpečnosti práce). Při zasažení očí vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut. Při zasažení oděvu a kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži omýt velkým množstvím pokud možno vlažné vody popř. mýdlem nebo jiným vhodným mycím prostředkem. Po umytí ošetřit vhodným reparačním krémem. Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2 litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.

OSN-SFáze před vyšetřením (příprava pacienta)OSN-E

Cholesterol je lipidovou frakcí, která se stanovuje nejčastěji. Dvě třetiny sérového cholesterolu má esterifikovanou podobu. Cholesterol se syntetizuje z acetyl-CoA téměř ve všech buňkách. Denní produkce je přibližně 1,2 g. Je substrátem pro tvorbu hormonů nadledvin a pohlavních hormonů a podílí se na tvorbě všech membránových struktur. Sérový cholesterol tvoří jen asi 7 % celkového cholesterolu. Téměř výlučně se metabolizuje v játrech, kde z něho vznikají žlučové kyseliny. Koncentrace cholesterolu v krvi je dána zčásti genetickými faktory a zčásti množstvím tuku (cholesterolu) přijatého s potravou.

Vyšetření cholesterolu se indikuje:

· cíleně při posouzení rizika u pacientů s projevy aterosklerózy,

· jako součást genetického screeningu v ohrožených rodinách,

· u pacientů s diabetes mellitus, hyperurikémií, tyreopatií, pankreatitidou,

· u obézních pacientů

· u pacientů s kožními projevy xantomů

· u pacientů s poruchami arteriálního periferního prokrvení.

OSN-SOdběr primárního vzorku (druh, nádobka, transport)OSN-E

Pro odběr a přípravu vzorků používejte pouze vhodné zkumavky anebo odběrové nádobky.

Stanovení se provádí v nehemolytickém séru nebo plazmě. Plazma – Li-heparinizovaná nebo K2-EDTA. Nepoužívejte citrát, oxalát nebo fluorid.

Odběr vyžaduje speciální přípravu pacienta:

a) alespoň 3 týdny před vyšetřením se mají dodržovat základní zásady správného stravování,

b) den před vyšetřením by měla mít strava hodnotu přibližně 7-8 KJ, večeře bez živočišných tuků,

c) hmotnost pacienta by měla být stabilní,

d) 12-14 hodin pacient má hladovět, 72 hodin nemá konzumovat alkohol

e) standardizovaná poloha pacienta vsedě.

Odběr se provádí ze žíly. Sérum je nutné oddělit od krevních elementů pokud možno nejrychleji.

Stabilita: separované sérum lze před analýzou uchovávat při teplotě 2 - 8° C 7 dní, při teplotě 15 – 25 °C je cholesterol stabilní 7 dní a při (– 15) – (-25) °C 3 měsíce.

OSN-SOmezení (interference a zkřížené reakce)OSN-E

Viz. Příbalový leták CHOL2, str.2/4.

OSN-SManipulace se vzorkyOSN-E

Podle běžných zásad práce s biologickým infekčním materiálem.

OSN-SPřístroje a pomůckyOSN-E

Analyzátor ROCHE Cobas pure – viz. SOPT Cobas pure.

OSN-SReagencieOSN-E

Souprava obsahuje:

· činidlo R1

Činidlo R1 (v pozici B)

PIPES pufr 225 mmol/l pH 6,8

Mg ionty 10 mmol/l

cholan sodný 0,6 mmol/l

fenol 12,6 mmol/l

4-aminoantipyrin 0,45 mmol/l

CHES ³ 25 µkat/l

CHOD ³ 7,5 µkat/l

POD ³ 12,5 µkat/l

Polyglykoléter mastného alkoholu: 3 %

Stabilizátory

konzervant

Činidla jsou stabilní do vyznačené body expirace v teplotě 2 – 8 °C. Roztok otevřený na palubě analyzátoru je stabilní 26 týdnů.

OSN-SSpotřební materiálOSN-E

Microcups typu Hitachi.

OSN-SPracovní postupOSN-E

Kazetu Cobas pure CHOL2 umístíme do prostoru pro reagencie. Připravíme kontrolní séra, které umístíme do příslušného stojanu do předem definovaných pozic a po ukončení měření QC modul v analyzátoru a také v LIS vyhodnotí výsledky pomocí Westgardových pravidel a určený pracovník, který rozhodne, zda odpovídající analýza může probíhat. Celková koncentrace se zjistí výpočtem podle optimální kalibrační křivky pomocí software analyzátoru.

Stanovení je měřeno při 37 °C při primární vlnové délce A/B 700/505 nm. Při koncentraci vyšší než měřící rozsah je výsledek označen kódem pro opakování měření z naředěného vzorku. Pipetuje se 1,1 µl séra.

OSN-SStručný popis postupuOSN-E

Obsluha provede kontrolu reagencií, kalibraci metod a následnou kontrolu metod (kontrolu provádí vysokoškolský určený pracovník). Analyzovaný materiál se umístí do určených stojánků dle matrice analyzovaného materiálu označený čárovým kódem. Požadavky analýz se předají do cobas pure on-line přes čárový kód z LIS a po provedení analýzy se převedou elektronicky zpět. Tyto výsledky jsou uchovávány v laboratorním systému LIMS fy DS Soft Olomouc.

OSN-SKalibrace a návaznostOSN-E

Ke kalibraci se využívá přípravek Calibrator for automated systems (C.f.a.s.) katalogové číslo 10759350190, výrobce ROCHE. Je to lyofilizované kalibrační sérum na bázi lidského séra. Koncentrace a aktivity byly vybrány tak, aby zajistily optimální kalibraci automatických analyzátorů, které nepoužívají kontinuální průtokový systém. Jako nulový kalibrátor je použita redestilovaná voda.

Návaznost: Tato metoda byla standardizována dle Abell-Kendalla a také podle metody izotopové ředění/hmotnostní spektrometrie..

Frekvence kalibrace: po změně šarže reagencie, podle požadavků provádění kontroly kvality.

Příprava

Po opatrném otevření lahvičky, aby se zabránilo jakékoliv ztrátě lyofilizátu, se přidá přesně 3 ml redestilované vody. Lahvička se pečlivě uzavře a obsah se rozpustí během 30 minut, za občasného opatrného promíchání kroužením lahvičky tak, aby se zabránilo pěnění. Netřepe se.

Stabilita

Kalibrátor v lyofilizovaném stavuje stabilní do data uvedeného na obalu. Po rozpuštění jsou složky kalibrátoru stabilní nejméně 8 hodin při laboratorní teplotě, 2 dny při 4 °C a 1 měsíc při -20 °C, pokud bylo jednou zamraženo. Kalibrátor byl připraven z krve dárců, testovaných individuálně na přítomnost HBsAG, HCV a HIV protilátek. Je nutné s ním zacházet dle pravidel o bezpečnosti práce s biologickým materiálem.

Vlastní kalibrace

Koncentrace se vybírá v přiloženém atestu ke kalibrátoru a závisí na šarži a metodě. Kalibrace je jednobodová, závislost je lineární, přímka prochází počátkem. Kalibrační faktor se vypočítává pomocí softwaru analyzátoru. Rekalibrace metody se provádí na základě výsledků kontroly správnosti. Kalibrační data jsou automaticky archivována v softwaru analyzátoru.

OSN-SCharakteristika spolehlivostiOSN-E

Měřící rozsah: 0,1 – 20,7 mmol/l

Vzorky s vyššími koncentracemi stanovte použitím funkce rerun. Vzorky ředíme 1:10 pomocí této funkce, výsledky jsou automaticky násobeny faktorem 10.

Mez detekce 0,1 mmol/l

Mez detekce představuje nejnižší měřitelnou hladinu analytu, kterou lze odlišit od nuly. Počítá se jako hodnota ležící 3 SD od nulového vzorku (nulový vzorek + 3 SD, opakovatelnost, n =21).

Mez stanovitelnosti: 0,1 mmol/l

Mez stanovitelnosti je nejnižší koncentrace analytu, kterou lze reprodukovatelně měřit s celkovou chybou 20 %. Zjištěna byla použitím vzorků cholesterolu s nízkými koncentracemi.

Biologický rozptyl - intraindividuální: kolísání v průběhu dne a ze dne na den, závislost na poloze pacienta při odběru (poloha vleže způsobuje pokles cholesterolu)

- interindividuální: závislost na pohlaví, věku.

- celkový

OSN-SDokumentace, výpočty, zpracování dat a vydávání výsledkůOSN-E

Hodnoty poslední provedené kalibrace se uchovávají v paměti přístroje. V případě potřeby je možné je vytisknout.

Záloha veškerých primárních dat (kalibrace, kontrolní vzorky, pacientské vzorky) probíhá na analyzátoru Cobas pure každý den automaticky na flash disk umístěný v počítači analyzátoru a sekundární data (pacientské vzorky, QC) jsou zálohovány v LIS taktéž každý den automaticky probíhající zálohou LIS.

OSN-SReferenční, varovné nebo kritické hodnotyOSN-E

Referenční hodnoty

fS Cholesterol (mmol/l)

Hodnocení rizika Celkový cholesterol

Žádoucí hladina cholesterolu 2,9 – 5,0

Hraničně zvýšený cholesterol 5,0 -7,8

Zvýšený cholesterol > 7,8

OSN-SInterpretace výsledků, konzultační činnosti a hlášeníOSN-E

Hodnoty se udávají v mmol/l, po kontrole na oddělení. Výsledky se vydávají v elektronické a i papírové podobě, statimové a kritické výsledky podléhající hlášení jsou hlášeny telefonicky.

OSN-SŘízení kvalityOSN-E

Jako kontrolní materiál se používá PreciControl ClinChem Multi 1 a PreciControl ClinChem Multi 2 fy ROCHE, lyofilizované kontrolní séra na základě bovinního albuminu se základními aktivitami v normálním rozmezí. Přidané enzymy zvířecího původu mají vlastnosti podobné enzymům z lidského séra.

Připravují se dokonalým rozpuštěním obsahu lahvičky v 5 ml deionizované vody za pomalého kroužení. Po 5 minutách jsou připraveny k použití, pro stanovení ALP se nechává stát další 1 hodinu při laboratorní teplotě. Používají se stejným způsobem jako vzorek, datum exspirace je udáno na každém balení.

Do měření se zařazují každý den a výsledky jsou vyhodnoceny podle Westgardových pravidel v analyzátoru v QC modulu a taktéž v LIS v QC modulu. Veškeré NO v QC jsou zdokumentovány v LIS.

EHK

Externí kontrola kvality v rámci České republiky je organizována SEKK a naše laboratoř se jí účastní 2-krát do roka v rámci cyklu AKS.

OSN-SPoznámky, zdroje variabilityOSN-E

OSN-SJiné související informaceOSN-E

OSN-SLiteraturaOSN-E

· Příbalový leták CHOL2

· Uživatelská příručka Cobas pure

· Racek, J. Klinická biochemie, Galén, 2021

· Richard Češka a kol.: Interna. 1. Praha: Triton 2010, str. 256

OSN-SAppendixyOSN-E

OSN-SDoporučení, recenze, schváleníOSN-E

Autor a spoluautoři: Stanovská Lenka

Vyjádření:

Revize: